with open("1.txt", "r") as f1, open("2.txt", "r") as f2:
same = set(f1).difference(f2)
same.discard("\n")
with open("3.txt", "w") as fo:
for line in same:
fo.write(line)
UPD. Извиняюсь, не обратил внимания, что нужны строки из файла 1 которых нет в файле 2, обновил.