Смотря чего вы хотите добиться. Без r бэкслеши просто перестают экранироваться
Можете просто экранировать бэкслеши с помощью бэкслешей.
main('C:\\Directory\\Path\\test.txt', 'C:\\Directory2\\Path\\')
Можно сделать так
main('C:/Directory/Path/test.txt', 'C:/Directory2/Path/')
Но было бы лучше использовать допустим os.path и передавать его